Generell ist der Zeitaufwand für das einbinden von weiteren Dateien per do, use oder require gegenüber dem direkten einbinden in die selbe Datei wie das Hauptprogramm IMHO vernachlässigbar.

do würde ich nicht benutzen. Es ist zwar erst mal die einfachste Möglichkeit, so was zu realisieren, es wird aber bei jedem Aufruf die Datei neu geladen. Wenn du ein Modul schreibst (ist gar nicht so schwer) und das per use einbindest, wird die Datei nur einmal geladen, egal wie oft du use aufrufst.