Auf Webservern nicht unbedingt. Bei Apache kann man z.B. konfigurieren, dass stattdessen die Einstellung aus der Registry für die Dateinamenserweiterung genutzt werden soll. Dazu muss man ScriptInterpreterSource auf Registry setzen und kann dann mit HKEY_CLASSES_ROOT\.pl\Shell\ExecCGI\Command\<Standard> bestimmen, was beim Aufruf einer Perl-Datei passieren soll. Dann kann da auch #!/usr/bin/perl stehen, obwohl perl.exe in C:\wo_auch_immer\perl.exe liegt.

Der Punkt ist, dass Windows selbst die Zeile völlig ignoriert, aber irgendwelche auf Windows laufenden Programme die Zeile natürlich auswerten können.